人胚肺成纤维细胞MRC5培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：人胚肺成纤维细胞MRC5

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：MEM + 10% FBS + 1% NEAA + 1% 丙酮酸钠 + 1% L-谷氨酰胺 + 1% P

传代方法：首次建议以1:2的比例进行传代

传代情况：每2天更换培养液

备注：使用无菌离心管收集瓶内培养基，留作对比培养。如果对比效果不佳，建议直接使用我们的完整培养基。

二、细胞接收后的处理

收到细胞后，请将其培养至良好状态，然后灌满完整培养液并封好瓶口，这是运输细胞的最佳方法。收到细胞后，用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，接着在超净工作台内严格进行无菌操作。将细胞瓶放于37℃、5% CO2的培养箱中，静置3-4小时以稳定细胞状态后再进行其他处理。使用显微镜观察细胞生长状态，并记录不同倍数下的细胞照片（最佳为40x、100x、200x各一张），前三天的照片将作为重要的售后依据。如果未提供照片，默认接受的状态为良好。

在传代后，建议一瓶使用原瓶的完整培养基，另一瓶则使用自配的完整培养基，以便进行对比培养。更换液体后，请将瓶盖稍微松开。

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

若细胞汇合度未超过80%，请将培养瓶中的完整培养液收集至离心管中，并保留5ml培养基，放入37℃、5% CO2的孵箱中继续培养。若细胞密度超过80%，可进行如下传代步骤：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS对细胞进行1-2次清洗。
2. 添加0.25% 胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放置于37℃培养箱中消化1-2分钟。
3. 在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大多数已变圆并逐渐脱落，迅速将其取回操作台，轻轻摇晃培养瓶后添加超过5ml完全培养基以终止消化。
4. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补充1-2ml完全培养基重悬。
5. 按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗一次。
2. 添加0.25% 胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞回缩和变圆后，加入5ml完全培养液终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其脱落后，将悬液转移至15ml离心管中，进行1000 RPM离心5分钟。
4. 弃去上清，沉淀后加入1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后装入冻存管中。
5. 将冻存管直接放入-80℃冰箱中，如需后期转入液氮罐，请先在-80℃冰箱中存放24小时以上。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（请佩戴防护面具），迅速置于37℃水浴中解冻，直至不再有结晶现象。
2. 用75%酒精擦拭冻存管外壁。
3. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，进行1000 RPM离心5分钟。
4. 弃去上清，沉淀并用5ml完全培养基重悬后，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。
5. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，一些细胞可能会由于贴壁不牢而发生脱落，这是正常现象。如脱落的细胞数量较多，请将培养瓶内的培养液收集至离心管，进行1000 RPM离心5分钟，并收集上清用于过渡培养。在此之后，可加入胰蛋白酶1-2ml，轻轻吹打，重悬并消化1-2分钟后再加入5ml完全培养基以终止反应。再进行离心，弃去上清后，加入1-2ml完全培养基重悬。最后，按照1:2比例进行分瓶传代并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

五、售后条款

1）可重发的情况及标准：

1. 运输过程中细胞遭遇问题，如丢失、瓶身破损、培养液严重泄漏等，均可重发。
2. 若细胞在收到后48小时内发现污染，请及时提供真实实验结果，经核实后可重发。
3. 常温发货的细胞静置24小时后或干冰冷冻发货的细胞24小时未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片），则可重发。
4. 干冰冷冻发货的细胞在复苏后24小时或者常温发货的细胞静置4小时且未开封时出现污染，均可重发。
5. 细胞活性问题需在收到产品7天内提供真实实验结果，若经台盼蓝染色法鉴定细胞活力未达标，经核实后重发。
6. 在收到产品当天及之后2-3天内拍照记录，未在3天内反馈视为产品合格。若在4-7天内发现问题，并提供收到细胞的前三天照片及问题发生时的照片，以及相关操作详细步骤，经过技术人员沟通后确认由我方责任，则可以重发；如是双方责任，则双方将协商处理，或按照合同价的50%收费进行重发。

2）不予重发的情况：

1. 因客户原因引起的细胞污染，不予重发。
2. 客户不正确操作导致细胞状态不良，不予重发。
3. 使用非本库推荐的细胞培养体系致使细胞状态不良，不予重发。
4. 如果细胞状态不良且未提供前三天的培养照片，不予重发。
5. 其他处理过的细胞，不予重发。
6. 在收到细胞后2天未反馈情况，不予重发。
7. 其他情况视具体情况而定。

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